第1讲　基因工程和细胞工程
一、基因工程
1．(2012·浙江卷T6)天然的玫瑰没有蓝色花，这是由于缺少控制蓝色色素合成的基因B，而开蓝色花的矮牵牛中存在序列已知的基因B。现用基因工程技术培育蓝玫瑰，下列操作正确的是(　　)
A．提取矮牵牛蓝色花的mRNA，经逆转录获得互补的DNA，再扩增基因B
B．利用限制性核酸内切酶从开蓝色花矮牵牛的基因文库中获取基因B
C．利用DNA聚合酶将基因B与质粒连接后导入玫瑰细胞
D．将基因B直接导入大肠杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞
【解析】　提取矮牵牛蓝色花的mRNA，逆转录得到DNA，然后扩增，可获得大量的基因B，A正确；从基因文库中获取目的基因，只要根据目的基因的相关信息和基因文库中的信息进行筛选对比即可，不需要用限制酶进行切割，B错误；目的基因与质粒的连接需要用DNA连接酶，而不是DNA聚合酶，C错误；目的基因需要和运载体连接后形成重组质粒再导入，而且应该用农杆菌进行感染，而不是大肠杆菌，D错误。
【答案】　A
2．(2012·新课标全国卷T40)根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)限制性内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有________和________。
(2)质粒运载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下：


为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种限制性内切酶切割，该酶必须具有的特点是_________ 。
(3)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即________DNA连接酶和________DNA连接酶。
(4)反转录作用的模板是________，产物是________。若要在体外获得大量反转录产物，常采用________技术。
(5)基因工程中除质粒外，________和________也可作为运载体。
(6)若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因________ 。
【解析】　限制性核酸内切酶可以将DNA分子切成两种类型的末端，平末端和黏性末端。两种不同酶切割之后便于相连，所产生的黏性末端必须相同。E·coli DNA连接酶可以连接黏性末端，T4 DNA连接酶可以连接两种末端。反转录是以mRNA为模板逆转录先合成单链DNA，再合成双链DNA，利用PCR技术进行大量扩增。基因工程中可以选用质粒、噬菌体、动植物病毒做运载体。当受体细胞是细菌时，为了增大导入的成功率，常用Ca2＋处理，得到感受态细胞，此时细胞壁和细胞膜的通透性增大，容易吸收重组质粒。
【答案】　(1)平末端　黏性末端　(2)切割产生的DNA片段末端与EcoRⅠ切割产生的相同　(3)T4　E·coli
(4)mRNA　cDNA　PCR(聚合酶链式反应)　(5)动植物病毒　噬菌体　(6)未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱
二、细胞工程
3．(2011·江苏卷T14)关于现代生物技术应用的叙述，错误的是(　　)
A．蛋白质工程可合成自然界中不存在的蛋白质
B．体细胞杂交技术可用于克隆动物和制备单克隆抗体
C．植物组织培养技术可用于植物茎尖脱毒
D．动物细胞培养技术可用于转基因动物的培育
【解析】　蛋白质工程是通过对基因进行一定程度的改造，进而合成新的蛋白质，以满足人们的需求；植物组织培养中，由于茎尖几乎不含或含少量病毒，因此可以培育出无病毒植株；在转基因动物的培育过程中，可利用动物细胞培养技术，使获得外源基因的受体细胞增殖。B项中的体细胞杂交技术，目前仅指向于植物体细胞杂交，由此获得杂种植株。
【答案】　B
4．(2012·江苏卷T31)某研究组对籼稻展开了组织培养及相关研究，请回答下列问题。
(1)2,4­D常用于籼稻愈伤组织的诱导，对形态的发生有一定的抑制作用。为促进愈伤组织再分化，在配制分化培养基时需________(填“升高”、“保持”或“降低”)2,4­D的浓度。
(2)当籼稻愈伤组织在只含有细胞分裂素的培养基上培养时，出现具有分生能力的绿色芽点，但不能继续出芽，通常在培养基中添加________，以促进幼苗形成。
(3)研究中用显微镜可以观察到的现象是________(填下列序号)。
①绿色芽点细胞排列松散
②刚融合的籼稻和稗草杂交细胞发生质壁分离
③胚状体细胞中有叶绿体
④分化的愈伤组织内各细胞的形态大小一致
(4)经组织培养筛选获得的籼稻叶绿素突变体，其叶绿素a与叶绿素b的比值显著大于对照，叶绿素总量不变。某同学用________(填序号：①绿色；②红色；③蓝紫色；④黄色)光照射突变体和对照叶片，检测到两者光合放氧速率差异不大。若取等量色素提取液进行层析，会发现突变体第________条色素带(自上而下)窄于对照组。
(5)胚乳(3n)由一个精子与两个极核受精发育而成。若用籼稻种子的胚乳诱导愈伤组织，培育三倍体，需适时剔除胚，以免胚的存在影响愈伤组织细胞的________，还可避免再生苗中混有________________。
【解析】　(1)2,4­D常用于植物愈伤组织的诱导和生长，但它趋向于抑制植物形态的发生，当愈伤组织再分化形成新的植株个体时，要减小2,4­D抑制植物形态的发生的作用。所以在配制分化培养基时需降低2,4­D的浓度。
(2)根据题意，此时已经出现具有分生能力的绿色芽点，但不能继续出芽。由于生长素促进再分化过程中芽的生长，所以在培养基中添加适量的生长素以促进幼苗形成。
(3)绿色芽点细胞是具有分生能力的细胞，排列紧密；刚融合的杂种细胞没有细胞壁，不可能发生质壁分离；分化后的细胞在形态、结构和生理功能上会发生稳定性的变化；胚状体的细胞是已经分化的具有生根发芽能力的细胞，其中有的细胞含有叶绿体，可在光学显微镜下观察到叶绿体。
(4)色素具有不同的吸收光谱，叶绿素a、b主要吸收的是红光和蓝紫光，而对绿光和黄光吸收很少。在本题中，通过光合放氧速率反映出二者光合作用强度的大小，自变量是叶绿素a、b比例上的差异。从结果来看，二者放氧速率差异不大，而突变体中叶绿素a与叶绿素b的比值显著大于对照，说明该同学用的光不是红色和蓝紫色，应该是绿色和黄色。通过纸层析法分离色素时，叶绿素a、b分布于第3、4条(自上而下)。因为突变体中叶绿素a与叶绿素b的比值显著大于对照，所以会发现突变体第4条色素带窄于对照组。
(5)利用胚乳诱导愈伤组织，由于胚中含有植物激素，会影响愈伤组织的增殖和分化，所以需适时剔除胚。因为胚是由受精卵发育而来的，剔除胚可以避免再生苗中混有二倍体幼苗。
【答案】　(1)降低　(2)适量的生长素　(3)③
(4)①④　4　(5)增殖与分化　二倍体幼苗
1．基本工具
(1)限制性核酸内切酶：识别双链DNA的某种特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，形成平末端或黏性末端。
(2)DNA连接酶：连接两个DNA片段的磷酸二酯键，不能连接RNA。包括E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。
(3)载体：将目的基因导入受体细胞，能在宿主细胞中稳定存在并复制，具有遗传标记基因，具有多个限制性核酸内切酶的酶切位点。常使用的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒等。
2．基本操作步骤
(1)目的基因的获取
①从基因文库中获取。
②利用PCR技术扩增。
③用化学方法直接人工合成。
(2)基因表达载体的构建
①基因表达载体的组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因。
②基因表达载体的构建方法
(3)将目的基因导入受体细胞
(4)目的基因的检测与鉴定
①目的基因插入检测：DNA分子杂交技术。
②目的基因转录检测：(核酸)分子杂交技术。
③目的基因翻译检测：抗原—抗体杂交技术。
④个体生物学水平检测：根据目的基因表达出的性状判断。
3．蛋白质工程
(2012·福建卷)肺细胞中的let­7基因表达减弱，癌基因RAS表达增强，会引发肺癌。研究人员利用基因工程技术将let­7基因导入肺癌细胞实现表达，发现肺癌细胞的增殖受到抑制。该基因工程技术基本流程如图1。
请回答：
(1)进行过程①时，需用________酶切开载体以插入let­7基因。载体应有RNA聚合酶识别和结合的部位，以驱动let­7基因转录，该部位称为________。
(2)进行过程②时，需用________酶处理贴附在培养皿壁上的细胞，以利于传代培养。
(3)研究发现，let­7基因能影响癌基因RAS的表达，其影响机理如图2。据图分析，可从细胞中提取________进行分子杂交，以直接检测let­7基因是否转录。肺癌细胞增殖受到抑制，可能是由于细胞中______________(填“RAS mRNA”或“RAS蛋白”)含量减少引起的。
【解析】　(1)过程①表示基因工程操作步骤中基因表达载体的构建，在该过程中需要用限制性核酸内切酶(简称限制酶)对载体进行切割，以便于目的基因的插入；启动子是一段特殊的DNA序列，是RNA聚合酶识别和结合的位点，RNA聚合酶结合到该位点，可驱动转录过程。
(2)过程②表示动物细胞培养，培养过程中出现接触抑制现象后，可以用胰蛋白酶处理，使之分散成单个细胞，随后分装到新的培养瓶中进行传代培养。
(3)判断目的基因是否在受体细胞中转录，可用分子杂交技术来检测，从细胞中提取mRNA和用放射性同位素或者荧光标记的目的基因单链DNA片段进行杂交。根据题中信息“肺细胞中的let­7基因表达减弱，癌基因RAS表达增强，会引发肺癌”可知，导入let­7基因后，肺癌细胞的增殖受到抑制；据图2可知，let­7基因影响RAS基因表达的机理是：let­7基因转录产物miRNA与RAS基因转录产物RAS mRNA结合，使RAS基因翻译受到抑制，引起细胞中的RAS蛋白含量减少，进而导致癌细胞增殖受抑制。
【答案】　(1)限制性核酸内切(或限制)　启动子
(2)胰蛋白　(3)RNA　RAS蛋白
1．(2011·浙江高考)将ada(腺苷酸脱氨酶基因)通过质粒pET28b导入大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。下列叙述错误的是(　　)
A．每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒
B．每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点
C．每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个ada
D．每个插入的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子
【解析】　将ada通过质粒pET28b导入大肠杆菌并成功表达，每个大肠杆菌细胞中至少含有一个重组质粒，且每个质粒(重组质粒)至少含有一个限制酶识别位点，但每个限制酶识别位点只能插入一个ada，插入的ada成功表达，说明每个插入的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子。
【答案】　C
2．(2012·海南卷)已知甲种农作物因受到乙种昆虫危害而减产，乙种昆虫食用某种原核生物分泌的丙种蛋白质后死亡。因此，可将丙种蛋白质基因转入到甲种农作物体内，使甲种农作物获得抗乙种昆虫危害的能力。回答下列问题：
(1)为了获得丙种蛋白质的基因，在已知丙种蛋白质氨基酸序列的基础上，推测出丙种蛋白质的________序列，据此可利用________方法合成目的基因。获得丙种蛋白质的基因还可用________、________方法。
(2)在利用上述丙种蛋白质基因和质粒载体构建重组质粒的过程中，常需使用________酶和________酶。
(3)将含有重组质粒的农杆菌与甲种农作物的愈伤组织共培养，筛选出含有丙种蛋白质的愈伤组织，由该愈伤组织培养成的再生植株可抵抗________的危害。
(4)若用含有重组质粒的农杆菌直接感染甲种农作物植株叶片伤口，则该植株的种子____ (填“含有”或“不含”)丙种蛋白质基因。
【解析】　(1)在已知蛋白质的氨基酸序列的情况下，可根据氨基酸和碱基的对应关系，推出合成该蛋白质的基因序列，然后用DNA合成仪通过化学方法来合成目的基因。此外也可以从基因文库中获取目的基因，也可通过PCR方法获取目的基因。
(2)构建重组质粒时，需要用限制酶将运载体切开，并用DNA连接酶将目的基因连接到运载体上，从而构建基因表达载体。
(3)愈伤组织中含有丙种蛋白质，说明丙种蛋白质的基因得到了表达，在培养成的植株体内也含有丙种蛋白质，乙种昆虫食用丙种蛋白质后会死亡，则该植株可抵抗乙种昆虫的危害。
(4)用含有重组质粒的农杆菌直接感染甲种农作物植株叶片伤口，仅仅在该叶片内的部分细胞中能合成丙种蛋白质，该植株的种子和其他的营养器官均不含有重组质粒，也就不含有丙种蛋白质的基因。
【答案】　(1)基因　化学　基因文库　PCR　(2)限制　DNA连接　(3)乙种昆虫　(4)不含
1.动物细胞培养与植物组织培养的比较
2.动物细胞克隆技术
(2012·广州重点中学联考)下列关于细胞工程的叙述，错误的是(　　)
A．电刺激可诱导植物原生质体融合或动物细胞融合
B．去除植物细胞的细胞壁和将动物组织分散成单个细胞均需酶处理
C．小鼠骨髓瘤细胞和经抗原免疫小鼠的B淋巴细胞融合可制备单克隆抗体
D．某种植物甲乙两品种的体细胞杂种与甲乙两品种杂交后代的染色体数目相同
【解析】　通过植物细胞工程中的植物体细胞杂交技术得到的甲乙两植物的体细胞杂种染色体数目是甲乙体细胞染色体之和；而通过有性杂交得到的甲乙两品种杂交后代的染色体数目是甲乙两品种体细胞染色体之和的一半(或两品种的配子所含染色体之和)。
【答案】　D
3．(2012·广东卷)培育草莓脱毒苗所采用的主要技术是(　　)
A．组织培养　　　　　 B．细胞杂交
C．显微注射 D．核移植
【解析】　草莓植株分生区的细胞含病毒的量比较少，可以利用植物组织培养技术培养出脱毒幼苗。
【答案】　A
4．(2012·上饶一模)人绒毛膜促性腺激素(HCG)是女性怀孕后胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，制备抗HCG单克隆抗体可用于早孕的诊断。下图是抗HCG单克隆抗体制备流程示意图，请分析回答：
(1)制备单克隆抗体过程中要用到____________和____________技术。
(2)制备单克隆抗体过程中，给小鼠注射的HCG相当于________，使小鼠产生分泌相应________的淋巴细胞，此过程属于特异性免疫中的________免疫。
(3)在B淋巴细胞内DNA合成有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤所阻断。而骨髓瘤细胞的DNA合成没有S途径。
①利用DNA合成途径不同的特点配制的HAT培养基含有多种成分，其中添加的________成分具有筛选杂交瘤细胞的作用。
②最终筛选获得的杂交瘤细胞的特点是__________ 。
(4)此过程生产的单克隆抗体可以与_________特异性结合，从而诊断早孕。
(5)哺乳动物在怀孕初期由于___________，为胚胎的收集提供了可能。收集到胚胎后还要对胚胎进行________，如果不直接向受体移植，还要放入________中保存。
【解析】　(1)由单克隆抗体制备的流程图知，骨髓瘤细胞需在体外进行培养而大量增殖，而骨髓瘤细胞与B淋巴细胞在促融剂的作用下融合后形成的杂种细胞必须在筛选培养基上进行筛选培养，获得的杂交瘤细胞还需进行克隆化培养。
(2)注射入小鼠体内的HCG是外来物质，相当于特定的抗原，当抗原进入小鼠体内后，经小鼠自身的体液免疫产生相应的浆细胞继而产生对抗抗原的特异性抗体。
(3)根据“鼠骨髓瘤细胞无S途径仅有D途径，以及D途径能被氨基嘌呤阻断”这方面考虑。若在培养基中加入氨基嘌呤，则鼠骨髓瘤细胞与鼠骨髓瘤细胞自身融合的细胞由于不能合成DNA而不能生存，人淋巴细胞与人淋巴细胞自身融合的细胞在体外不能分裂增殖也不能生存。故培养基中加入氨基嘌呤后只有杂种细胞能生存，可分离出能无限增殖并分泌特异性抗体的杂种细胞。
(4)生产的单克隆抗体使用的抗原是人绒毛膜促性腺激素即HCG，因此发生免疫应答的过程应是单克隆抗体和HCG的特异性结合。
(5)供体的早期胚胎形成后，在一定的时间内不会与母体子宫建立组织上的联系，而是处于游离状态，这就为胚胎的收集提供了可能。用特制的冲卵装置把供体胚胎收集后，对胚胎要进行质量检查，看此时的胚胎是否处于桑椹胚或囊胚期。收集的胚胎可直接向受体移植，否则应将其放入－196 ℃液氮中保存。
【答案】　(1)动物细胞培养　动物细胞融合
(2)抗原　抗体　体液
(3)①氨基嘌呤　②能无限增殖并分泌特异性抗体
(4)人绒毛膜促性腺激素(或“HCG”)
(5)早期胚胎在一定时间内不会与母体子宫建立组织上的联系，而是处于游离状态　质量检查　－196 ℃液氮
预计2013年高考，仍会以生物技术运用于生产的理念，以示意图或过程图为情景，让考生填充有关生物工程的基本操作及生物技术间的联系等知识中的一些关键词(如基因工程的操作程序或与细胞工程、胚胎工程等的综合运用等)。试题难度保持在0.55左右。
图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题：
(1)图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由___________ 连接。
(2)若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段，产生的末端是________末端，其产物长度为_______________ 。
(3)若图1中虚线方框内的碱基对被T—A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有________种不同长度的DNA片段。
(4)若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是________。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加________的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是_______ 。
【研析】　本题主要考查转基因技术中的操作工具与目的基因的筛选及DNA的复制等知识，旨在考查考生的提取信息能力、识图能力和分析推理能力。解题过程如下：
【答案】　(1)脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖　(2)平　537bp、790bp、661 bp
(3)4　(4)BamHⅠ　抗生素B　同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向连接