课题2 微生物的分离与计数
专题2 :微生物的培养与应用
课题1我们学习了培养基的配制以及微生物的培养（接种技术）。下面我们来学习如何进行细菌的分离，获得所需要的目的微生物，并对目的微生物进行培养计数。
一、研究思路
筛选菌株
自然界筛选：根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
实验室筛选：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。
选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。目的是从众多微生物中分离所需要的微生物。
测定微生物数量的方法：
1、直接计数法：最常用的显微镜直接计数。
先将待测样品制成悬液，然后取 一定量的悬液放在显微镜下进行计数。根据在显微镜下观察到的微生物数目来计算出单位体积内的微生物总数。
优点：设备简单、能观察微生物的形态特征。
缺点：不能区分死菌和活菌；
难以计数微小的细菌。
一般用于纯培养悬浮液中各种单细胞菌体的计数。
统计菌落数目
2、间接计数法：最常用稀释涂布平板计数法
应用：统计样品中活菌的数目
原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的 一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
（注意）：一般选择菌落数在30-300的平板 进行记数。
稀释度很重要，一般选择三个稀释度中的第二稀释度到平板所出现的平均菌落数在50个左右为最好。
操作：设置重复组，增强实验的说服力和准确性。将待测样品经过一系列的稀释，然后选择三个稀释度的菌液均匀涂布在平板上，然后培养。
（注意）：为了结果接近真实值，可将同一稀释度菌液涂布到3个或3个以上的平板上，经培养，计算出菌落的平均数。
对照原则：判断培养基中是否有杂菌污染，将未接种的培养基同时进行培养。
判断选择培养基是否具有筛选作用，对照培养基接种后培养观察菌落数目。
计算公式：每克样品中的菌株数=（C/V）*M
（1）原理：尿素是一种重要的农业氮肥，只有当土壤中 的 细菌将尿素分解成氨之后，才能 被植物利用。尿素细菌能合成脲酶，在脲酶的作用下尿素被分解成氨。
CO(NH2)2+H2O CO2+2NH3
二、实验设计
（2）实验设计的内容包括实验方案、材料用具、实施步骤和时间安排等。
（3）实验流程：
土壤取样

样品系列稀释

涂布平板与培养

观察并记录结果
菌落计数

1、土壤微生物主要分布在距地表3～8cm的近中性土壤中，
约70％～80％为细菌。
2、分离不同的微生物采用不同的稀释度，其原因是不同微生物在土壤中含量不同，其目的是保证获得菌落数在30～300之间、
适于计数的平板。
细菌稀释度为104、105、106，
放线菌稀释度为103、104、105，
真菌稀释度为102、103、104。
3、 培养不同微生物往往需要不同培养温度。
细菌一般在30～37℃培养1～2d，
放线菌一般在25～28℃培养5～7d，
霉菌一般在25～28℃的温度下培养3～4d。
4、 在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
点评：菌种中有些菌体增殖快，有些菌体增值慢，所以培养时间要充足，使得每个菌体都能形成肉眼可观察到的菌落。
5、菌落的特征包括 形状、大小、隆起程度、颜色 等方面。
阅读思考
三、结果分析与评价
（1）　对分离的菌种作进一步的鉴定，还需要借助 生物化学 的方法。
(2)　在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的 脲酶 将尿素分解成了 氨 。氨会使培养基的碱性 增强 ，PH 升高 。因此，我们可以通过检测培养基 pH 变化来判断该化学反应是否发生。
(3)　在以 尿素 为唯一氮源的培养基中加入 酚红 指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变 红 ，说明该细菌能够 分解尿素 。
[思考10]测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝 培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现 黑 色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。你认为在该实验中至少应取 三 个水样。
四、课堂总结、点评
五、课余作业
活菌计数技术广泛应用于土壤含菌量的测、食品卫生和水源污染度的检测。
选做：
1、空气中微生物总数的检测
2、水中细菌总数的检测
3、牛奶中 细菌的分离与计数
4、土壤中真菌（或放线菌）的分离与技术
练一练用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目，其结果与实际值相比（ ） A.比实际值高 B.比实际值低 C.和实际值一致 D.比实际值可能高也可能低
B
有些细菌含有尿素分解酶，能将尿素琼脂培养基中的尿素分解生成氨，氨溶于水变成氢氧化铵，导致培养基变成碱性，使酚红指示剂呈现红色。

下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是( )
A. KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、水
B. KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、琼脂、水
C. KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、尿素、琼脂、水
D. KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水
练一练
A